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細菌內毒素(脂多糖)提取法之三氯醋酸法及酚水法的介紹

發布時間: 2022-09-08  點擊次數: 1131次

內毒素系革蘭氏陰性菌細胞壁外膜中的脂多糖(Lipopoly saccharide,LPS)成分。在維持外膜的結構、通透性以及臨床陰性菌感染中均起著重要的作用。以化學方法提取的LPS注射動物能重復革蘭氏陰性菌感染期間所出現的多種病理反應,故實驗動物應用提取的LPS可更好地了解LPS的致病作用并尋找可能的防治對策。

 

 

一、三氯醋酸法(Trichloroacetic Acid,TCA)

 

TCA法是Boivin等(1933)首先應用的,借助0.25N TCA,在4℃可將LPS從濕菌或經丙酮干燥的細菌中提取出來,加入2倍體積的冷乙醇即可取得LPS的沉淀物。用這種方法提取的產物,嚴格地講是一種LPS-蛋自質復合物,這種復合物即方早期所稱的Boivin抗原。TCA法提取的LPS產量較高,具有很好的抗原性,對O特異性側鏈抗體有血清學特異反應,可結合補體和致敏紅細胞,分子量達幾百萬,但蛋白質含量很高,故純度較差。目前這一方法已較少使用。

 

二、酚水法

 

這一方法是Westphal等于1952年提出的,該法是目前應用最-廣泛的方法。酚水法主要用于S型細菌LPS的提取,亦可用于R突變型細菌LPS的提取,但產量稍低。酚水法提取液所含的苯酚與水的比例是45 : 55。當提取液加熱至68℃并維持5分鐘時,苯酚和水形成了一個單一的相,冷卻至4℃后,形成了兩個相,分別為苯酚相(被水飽和)和水相(被苯酚飽和)。核酸、多糖及LPS大部分溶解于水相中,而大部分蛋白質溶解于苯酚相中,不溶性物質沉淀在兩相交界處。

 

含LPS的水相經吸取、透析<去除苯酚)并干燥后即為LPS的粗制品。LPS粗制品經超離心1000000×g,可得到精制的LPS。精制后的LPS,尚含有多糖成分及與其共價結合的類脂體A成分、小量的肽(1~3 %)。這種提取物對人、兔的抗原較弱,但能展示O特異性側鏈抗原反應。內毒素毒性較強,致敏紅細胞不明顯,能結合補體,分子量有幾百萬。產量僅1~4 %(占干菌重)。

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